“盘他”or“走为上”？《Neuron》新发现阐释逃避行为的环路机制

“人们称之为逃避行为。那也无所谓，由人们说去好了。我的人生是我的，你的人生是你的。只要你清楚自己在寻求什么，那就尽管按自己的意愿去生活。别人怎么说与你无关。那样的家伙干脆喂大鳄鱼去好了。过去在你这样的年纪我就这样想，现在也还是这样认为，或许因为我作为一个人还没有成熟，要不然就是我永远正确。我弄不明白，百思不得其解。”

——村上春树《舞！舞！舞！》

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逃避行为，即面对各种挑战时，不尝试去克服，而倾向于躲避的行为。逃避是趋利避害的表现，本身无可厚非，但如果逃避成为了习惯，感到不舒服便马上另寻慰籍，长期如此则可能导致焦虑症等神经疾病。

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对于逃避行为，两个月前我们的一篇文章曾讲述过大脑杏仁核内侧核具有两条下游通路，一部分促进逃避行为，另一部分促进探索行为[1]。今天，我们将视角转移到一个更高级的脑区——前额叶皮层中，由小编我来带领大家探寻逃避行为的终极奥义。

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首先，我们来介绍一下血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）神经元。在新皮层中，VIP神经元是一类抑制性中间神经元，这类神经元会抑制其他类型抑制性中间神经元，从而去抑制皮层兴奋性神经元对各类刺激的反应[2]，进而改变神经网络活性与行为表征[3]。然而关于VIP神经元，有很多悬而未决的问题。其一，我们是否可以找出VIP神经元活性与行为学表征之间的明确对应关系，即活性变化程度是否与行为变化水平呈正相关？其二，VIP神经元活性变化对行为学的影响是否依赖于当前神经网络的状态？例如，已知一类皮层输入驱动一种行为，那么改变VIP神经元活性对此行为的影响是否依赖于上述皮层输入的强弱呢？这些问题均为我们了解神经网络如何精确介导、调控行为的鸿沟巨壑。 

VIP的结构

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为解决上述问题，我们还需了解一种行为学范式：高架十字迷宫（elevated plus maze，EPM）。EPM由两条开放臂、两条闭合臂与中间区域组成，小鼠会先天性躲避高耸的开放臂，趋向更有安全感闭合臂。然而，关于VIP中间神经元在此逃避行为中所扮演的角色，我们尚未可知。

高架十字迷宫，EPM

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2019年4年30日，《Neuron》杂志在线刊登了加州大学旧金山分校Vikaas S. Sohal教授的最新重要工作[4]，他们以EPM作为行为学范式，发现VIP神经元可去抑制海马-前额叶环路，进而驱动小鼠对EPM开放臂的逃避行为。此外，抑制VIP神经元会改变小鼠的决策，增加小鼠对开放臂的探索行为，但仅在海马-前额叶θ波同步化较强时发挥作用。该研究以单细胞水平解析VIP神经元在逃避行为神经环路中的功能，阐释了前额叶皮层在逃避行为决策过程中的关键性环路，极大提高了我们在逃避行为领域中的认知。

Vikaas S. Sohal教授

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结果

1.EPM开放臂中VIP神经元活性上升

为研究小鼠探索EPM时VIP中间神经元的活性，作者使用光纤钙信号记录方法，在VIP-Cre小鼠的mPFC中注射AAV-DIO-GCaMP6s并植入光纤（图1A-B），发现小鼠在EPM中间区域及开放臂中VIP神经元活性显著上升（图1C-D）。此外，每当小鼠进入中间区域时，VIP神经元活性也显著上升（图1E）。 

图1 EPM开放臂和中间区域中VIP神经元活性上升

2.VIP神经元活性预测逃避行为与探索行为

上文中，我们得知小鼠探索开放臂时VIP神经元被激活。但是究其机制，有很多种模型可以解释。其一，VIP神经元编码开放臂探索行为；其二，VIP神经元活性表征焦虑水平，促进开放臂逃避行为；其三，VIP神经元与躲避和探索的决策无关，仅仅编码位置信息。那么，究竟哪个模型是真实的呢？作者就此展开以下研究。

他们使用相同方法记录mPFC VIP中间神经元钙信号，分离出所有从闭合臂出发的轨迹，以闭合臂-中间区域-闭合臂轨迹表征逃避行为，以闭合臂-中间区域-开放臂表征探索行为。发现小鼠在闭合臂-中间区域-闭合臂轨迹中mPFC VIP神经元活性显著升高，而闭合臂-中间区域-开放臂轨迹中活性不变（图2A-B），其中A图为小鼠在中间区域中VIP神经元活性，B图为小鼠在闭合臂中VIP神经元活性，表明mPFC VIP中间神经元的高活性预示着逃避行为。

图2 VIP神经元活性预测逃避行为与探索行为

3.抑制VIP神经元减少开放臂逃避行为预测逃避行为

为进一步研究VIP神经元在EPM逃避行为中的功能，作者使用光遗传方法，在VIP-Cre小鼠的mPFC中双侧注射AAV-DIO-eArch3.0并植入光纤（图3A），在小鼠进入中间区域、开放臂时以532nm绿光抑制mPFC VIP神经元（图3B-C），发现小鼠逃避行为显著减少，表现为开放臂逗留时间延长、进入次数增加（图3D-F），表明VIP神经元活性在逃避行为中具有必要性。 

图3抑制VIP神经元减少开放臂逃避行为，增加探索行为

4.VIP神经元去抑制海马-前额叶输入

从上文结果中，我们得知mPFC中VIP中间神经元编码逃避行为，接下来作者究其环路机制展开研究。过去的研究表明，腹侧海马（ventral hippocampus, vHPC）到mPFC的输入编码EPM开放臂的逃避行为[5]，于是作者推测VIP中间神经元调控mPFC神经元对vHPC的反应以驱动逃避行为。

为证实上述推测，作者在VIP-Cre小鼠的vHPC注射AAV-ChR2，在mPFC注射AAV-DIO-eNpHR3.0，通过膜片钳电生理方法记录mPFC 2/3层椎体神经元（图4A）。他们发现，抑制VIP中间神经元后，mPFC 2/3层椎体神经元发放频率显著降低。电压钳结果显示，抑制VIP中间神经元后，mPFC 2/3层椎体神经元的兴奋性突触后电流无变化，抑制性突触后电流增加（图4B-C）。上述结果表明，VIP神经元去抑制接受vHPC投射的椎体神经元。

图4 VIP神经元去抑制海马-前额叶环路输入

5.抑制VIP神经元扰乱mPFC对逃避行为的编码

上文已知，VIP中间神经元去抑制海马-前额叶输入，且海马-前额叶输入编码逃避行为，那么此去抑制作用是否参与EPM逃避行为的编码呢？

为解决此问题，首先需要鉴别编码逃避行为的前额叶神经网络活动，其次需探究抑制VIP中间神经元对上述网络活动的影响。作者引入双色显微内窥镜，在VIP-Cre小鼠的mPFC中注射AAV-GCaMP以及AAV-DIO-eNpHR，光抑制VIP神经元同时记录mPFC神经元活性（图5A-C）。再此记录方法之下，作者将时间分隔为2.5秒的时间段，并计算钙信号与小鼠位置（开放臂或闭合臂）相关矩阵（图5D-E）。他们发现，光抑制VIP神经元后，开放臂与闭合臂的相关性差异显著下降（图5F-G），他们还发现抑制VIP神经元减少闭合臂与开放臂的差异程度和抑制VIP神经元减少开放臂逃避行为的程度高度相关（图5H）。

终上所述，小鼠对开放臂与闭合臂的决策需要特定前额叶神经网络活动编码，若VIP神经元被抑制，上述神经网络活动紊乱，进而影响小鼠对开放臂的逃避行为。 

图5 抑制VIP神经元扰乱mPFC对逃避行为的编码

6.抑制VIP神经元仅当海马-前额叶θ波同步化较强时减少开放臂逃避行为

基于前文结果，作者假设VIP中间神经元通过增强海马-前额叶输入从而编码开放臂逃避行为，那么相应环路机制有以下几种模型：其一，VIP中间神经元仅仅增加海马-前额叶强输入的反应；其二，VIP中间神经元增加mPFC神经元对海马弱输入的敏感性；其三，VIP中间神经元调控小鼠逃避行为不依赖于海马投射（图6A）。那么，哪种模型是真的呢？

过去的研究表明，θ振荡同步是海马-前额叶输入的标志，尤其当机体处于EPM等焦虑环境下[5]。为研究VIP神经元的环路机制，作者在VIP-Arch小鼠的mPFC和vHPC中植入不锈钢电极，mPFC中毗邻电极植入光纤（图6B）。他们分离出EPM中θ振荡同步的轨迹，发现光抑制VIP神经元并不影响θ振荡同步状态，却显著减少开放臂逃避行为，而θ振荡同步较弱的轨迹中逃避行为不受影响（图6C-D），表明VIP神经元只在海马-前额叶强输入时去抑制mPFC投射性神经元以驱动逃避行为。

图6抑制VIP神经元仅当海马-前额叶θ波同步化较强时减少开放臂逃避行为

总结

VIP神经元是一类抑制性中间神经元，这类神经元在新皮层中会抑制其他类型抑制性中间神经元，从而去抑制皮层兴奋性投射神经元。然而，对于VIP神经元活性与行为学表征水平之间的相关性，以及VIP神经元去抑制效应是否依赖于皮层接受的输入强度，我们知之甚少。本篇文章结合光遗传、电生理、钙信号记录、内窥镜等方法，发现mPFC中VIP神经元活性越强，小鼠越倾向于躲避开放臂。此外，VIP神经元可通过去抑制海马-前额叶输入以编码小鼠在EPM中对开放臂的逃避行为，且此调控作用仅在海马-前额叶θ波同步化较强时生效（图7）。本篇文章首次发现VIP中间神经元调控逃避行为的神经网络活性状态以及精细环路机制，为临床治疗焦虑症等神经疾病提供有力支持！

图7 mPFC中VIP神经元调控逃避行为的环路机制示意图

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参考文献

1.Miller, S.M., et al., Divergent medial amygdala projections regulate approach-avoidance conflict behavior. Nat Neurosci, 2019. 22(4): p. 565-575.

2.Karnani, M.M., et al., Opening Holes in the Blanket of Inhibition: Localized Lateral Disinhibition by VIP Interneurons. J Neurosci, 2016. 36(12): p. 3471-80.

3.Kamigaki, T. and Y. Dan, Delay activity of specific prefrontal interneuron subtypes modulates memory-guided behavior. Nat Neurosci, 2017. 20(6): p. 854-863.

4.Lee, A.T., et al., VIP Interneurons Contribute to Avoidance Behavior by Regulating Information Flow across Hippocampal-Prefrontal Networks. Neuron, 2019.

5.Padilla-Coreano, N., et al., Direct Ventral Hippocampal-Prefrontal Input Is Required for Anxiety-Related Neural Activity and Behavior. Neuron, 2016. 89(4): p. 857-66.